谷胱甘肽過氧化物酶（GPx)活性檢測試劑盒改進說明書 
1. 谷胱甘肽過氧化物酶活性檢測試劑盒簡介 谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，可以清除活細胞內(nèi)的過氧化物，保護細胞免受自由基損傷。GPx催化還原型谷胱甘肽(GSH)還原H2O2和多種有機過氧化物，從而消除活性氧的毒害作用。
2. GPx活性測定受到粗酶液中過氧化氫酶的干擾
GPx可以催化2 GSH氧化生成1 GSSG，而谷胱甘肽還原酶可以利用NADPH催化1 GSSG產(chǎn)生2 GSH，其中GPx是限速酶。因此，通過檢測NADPH的減少速率即可計算GPx活性。H2O2是最常見的過氧化物，以往科銘的試劑盒也是采用了H2O2作為底物。
但是底物H2O2也可以被粗酶液中普遍存在的過氧化氫酶(Catalase)催化分解，干擾GPx活性測定。在樣本中CAT活性不高的情況下，這種干擾不會對測定產(chǎn)生顯著影響。但當遇到肝臟等CAT活性較高的樣本時，會極大干擾GPx測定。
3. GPx測定方法的改進思路
要避免CAT干擾，主要有兩種思路。一種是去除或抑制CAT的活性，另一種是選擇不受CAT催化反應的底物。常見的CAT抑制劑有疊氮化鈉等。但是疊氮化鈉屬于危險化學品。
GPx可以催化還原多種有機過氧化物，而CAT則不會與有機過氧化物發(fā)生反應。參考了文獻報道，并進行實驗驗證后，我們選用了叔丁基過氧化氫作為底物。叔丁基過氧化氫不會與GSH發(fā)生自發(fā)性反應，也不會被CAT催化分解。同時，叔丁基過氧化氫不會被不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶催化，因此可以特異性的檢測最常見的含硒的GPx活性。
4. 改進后谷胱甘肽過氧化物酶活性測定試劑盒的優(yōu)勢
4.1 適用于不同類型的樣本
可測定動植物組織、血清等（圖1）。 
圖1:不同樣本GPx吸光值差值對比
4.2 受到CAT干擾更小，反應穩(wěn)定性更好
圖2顯示，在CAT的干擾下，吸光值出現(xiàn)無規(guī)律的劇烈波動，這是因為CAT消耗了底物，同時產(chǎn)生大量氣泡，極大干擾了測定。 
圖2:改進前的小鼠肝臟樣本10分鐘內(nèi)吸光值變化 
圖3顯示，改進后，CAT的干擾被排除，吸光值穩(wěn)定下降，并最終耗盡底物進入平臺期。
5. GPx活性檢測試劑盒改進體會 酶活性測定中，除了要保證測定原理可靠外，更要注意干擾物質(zhì)的影響。在谷胱甘肽過氧化物酶活性測定試劑盒中，我們通過谷胱甘肽還原酶間接測定GPx活性，屏蔽了一部分干擾。而在此次改進中，我們使用特異性更強的底物，將底物可能產(chǎn)生的干擾也降到最低，才保證了測定結(jié)果的穩(wěn)定可靠。 這次改進的過程中我認識到，必須從源頭開始，利用底物、酶、反應原理的特異性，逐步排除干擾，才能得到真正可靠的試劑盒。
科銘試劑盒都是自主研發(fā)的，經(jīng)過了各種各樣生物樣本實際測定的檢驗，并且根據(jù)試劑盒用戶的反饋和我司代測員工的報告，對試劑盒加以改進，以確保試劑盒的質(zhì)量。此外，原鑫生物特別強調(diào)并且協(xié)助用戶做好預實驗和預測定，必要時科銘對用戶測定結(jié)果進行驗證，以保證樣本質(zhì)量可靠和測定結(jié)果真實。
文章來源：http://www.www.linkeyuan.cn/newss-164.html
|
400-788-2680
