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維生素D需經過兩步的酶促反應(25-羥基化作用和1α-羥基化作用),才能產生有活性的1α,25(OH)2D.其中,CYP2R1是生物體內催化維生素D的25-羥基化作用的關鍵酶,該過程是活性維生素D合成的重要環節.目前,國內外對小鼠CYP2R1的認識還非常有限,其蛋白結構,理化性質和病理學功能等也尚不清楚.此外,隨著維生素D缺乏癥的發生,維生素D的需求量增加,其生物學轉化也具有廣闊的應用前景,因此,維生素D 25-羥基化酶CYP2R1的相關研究顯得尤為重要.本研究首先利用生物信息學軟件對小鼠CYP2R1序列進行分析,為小鼠CYP2R1理化性質的研究及其定向改造提供參考;其次,克隆小鼠CYP2R1基因并在宮頸癌(Hela)細胞中進行表達,以構建真核高表達載體,為活性維生素D的生物學轉化提供實驗基礎;此外,通過細胞劃痕實驗,MTT檢測和qPCR檢測,初步探討小鼠CYP2R1對Hela細胞增殖的影響。


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為小鼠CYP2R1的相關功能研究提供了實驗基礎.主要結Arg131,Arg138,Lys434,Lys435,Arg445,Arg455.以結構明確的人CYP2R1為標準,比較了11個物種CYP2R1的二級結構;并以人CYP2R1結構為模板,對小鼠CYP2R1進行了同源建模,比較了小鼠CYP2R1與人CYP2R1三級結構的差異.(2)利用融合有His標簽的pcDNA3.1(+)構建了小鼠CYP2R1真核表達載體pcDNA3.1-CYP2R1,該載體能有效提高CYP2R1的mRNA和蛋白表達水平,其中mRNA水平提高了82524.59倍.(3)小鼠CYP2R1能夠同時上調細胞周期調控因子CyclinD1,P27和P21基因的表達,其中重組質粒轉染組的CyclinD1和P27的相對表達量相比空載質粒轉染組具有極顯著差異(p0.01).推測CYP2R1參與了CyclinD1和P27對細胞周期的調控,但可能形成反饋調節系統CyclinD1-CDK-P27,導致Hela細胞的增殖變化不明顯。


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